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細胞凋亡（Apoptosis），作為一種深入研究的程序性細胞死亡形式，近年來(lái)已成為生物學(xué)領(lǐng)域的熱門(mén)課題。如果你的研究涉及癌癥機制與療法、藥物篩選與藥理作用、生物發(fā)育、免疫學(xué)或神經(jīng)科學(xué)等領(lǐng)域，細胞凋亡檢測無(wú)疑是你實(shí)驗設計中重要的一環(huán)。
在本期的細胞學(xué)堂中，我們將深入介紹不同類(lèi)型凋亡檢測試劑盒的相關(guān)知識，并分享一些關(guān)于如何選擇凋亡檢測試劑盒的經(jīng)驗，旨在幫助您輕松理解并為您的樣本選擇合適的凋亡檢測試劑盒。
凋亡細胞在細胞形態(tài)和生理上與壞死細胞和正常細胞存在顯著(zhù)不同，其細胞膜、細胞質(zhì)、細胞核、核酸以及凋亡相關(guān)蛋白都發(fā)生明顯變化，具有鮮明特征。這些差異為我們提供了檢測細胞凋亡的多種方法。常用的細胞凋亡檢測方法包括形態(tài)學(xué)觀(guān)察、細胞膜磷脂外翻檢測、凋亡相關(guān)蛋白檢測、DNA斷裂檢測、細胞周期分析等。這些方法各有特點(diǎn)，可以根據實(shí)驗需求和條件選擇合適的檢測方法。
根據細胞凋亡的機制和特點(diǎn)，普諾賽®自主研發(fā)了Annexin V凋亡檢測試劑盒、TUNEL凋亡檢測試劑盒、Caspase活性檢測試劑盒和線(xiàn)粒體膜電位(JC-1)檢測試劑盒。
檢測原理：Annexin V是一種鈣離子依賴(lài)性磷脂結合蛋白，與磷脂酰絲氨酸（PS）有高度親和力。在正常細胞中，PS通常位于細胞膜內側。然而，當細胞發(fā)生凋亡時(shí)，細胞膜的通透性會(huì )發(fā)生變化，細胞膜內側的PS部分外翻，暴露到細胞膜外側。Annexin V可通過(guò)與凋亡早期細胞胞外翻的PS結合，從而識別凋亡細胞。為了更便于檢測，將Annexin V標記上熒光染料，可通過(guò)流式細胞儀或熒光顯微鏡等設備檢測到帶有熒光的凋亡細胞。細胞核染料（PI、DAPI、7-AAD）可與雙鏈DNA特異性結合，并產(chǎn)生強烈的熒光。正常情況下大分子的核染料是無(wú)法透過(guò)細胞膜，由于凋亡晚期或壞死細胞膜喪失完整性，細胞核染料可進(jìn)入細胞內對DNA進(jìn)行染色，與Annexin V搭配使用，可區分處于不同凋亡時(shí)期的細胞。
檢測原理：在細胞凋亡的晚期，染色體DNA雙鏈斷裂產(chǎn)生大量的粘性3'-OH末端。在脫氧核糖核苷酸末端轉移酶（TdT）的作用下，脫氧核糖核苷酸與熒光素等標記物形成的衍生物可以被標記到斷裂DNA的3'-末端，從而進(jìn)行凋亡細胞的檢測。
檢測原理：Caspase是一個(gè)蛋白酶家族，通常以無(wú)活性的酶原形式存在于細胞質(zhì)中?；罨腃aspase會(huì )破壞一些重要的胞內蛋白，從而引發(fā)凋亡的發(fā)生。將Caspase序列特異性的多肽酶偶聯(lián)至黃色基團pNA作為底物，當Caspase被活化后，它能夠剪切這個(gè)底物，釋放出游離的黃色基團。通過(guò)酶標儀或分光光度計測定這些黃色基團的吸光值，就可以定量評估Caspase的活性，從而間接地監測細胞凋亡的情況。
檢測原理：在正常細胞中，線(xiàn)粒體膜電位通常較高，JC-1主要在線(xiàn)粒體基質(zhì)中聚集，以聚合體的形式存在，可產(chǎn)生紅色熒光。然而，在細胞凋亡的早期階段，線(xiàn)粒體膜電位會(huì )顯著(zhù)降低，導致JC-1無(wú)法在線(xiàn)粒體基質(zhì)中積累，主要以單體形式存在，可產(chǎn)生綠色熒光。通過(guò)JC-1從紅色熒光到綠色熒光的轉變可檢測到細胞膜電位的下降，可將JC-1熒光顏色的轉變作為細胞凋亡早期的檢測指標。
目前市售的凋亡檢測試劑盒種類(lèi)眾多，如何選擇一款匹配自己檢測樣本和實(shí)驗條件的試劑盒至關(guān)重要。以下是兩點(diǎn)可供參考的建議：
01
基于樣本類(lèi)型選擇
根據具體實(shí)驗設計和樣本類(lèi)型，選擇合適的凋亡檢測試劑盒。推薦您參考下方表格所示的內容，以便為您的樣本類(lèi)型選擇適當的凋亡檢測試劑盒。例如懸浮細胞或經(jīng)消化下來(lái)的貼壁細胞，四種凋亡試劑盒都可考慮使用，這些試劑盒通常能夠適用于不同類(lèi)型的細胞樣本。然而，對于組織樣本，需要注意不同的試劑盒樣本制備方法可能不同。使用TUNEL凋亡檢測試劑盒時(shí)，需制備石蠟或冷凍切片，而使用Caspase活性檢測試劑盒時(shí)，則需對組織進(jìn)行機械剪碎、勻漿和裂解。
02
基于實(shí)驗儀器和配置選擇
不同凋亡檢測試劑盒的使用需要配備對應的儀器。推薦您參考下方表格，根據實(shí)驗室現有的實(shí)驗儀器，選擇合適的凋亡檢測試劑盒。需要提醒的是，除了確認儀器是否可用，還需要了解實(shí)驗儀器的具體配置，例如流式細胞儀的熒光檢測通道和熒光顯微鏡的濾光片組等。
市售的Annexin V凋亡檢測試劑盒和TUNEL凋亡檢測試劑盒，有多種熒光染料組合可供選擇。在選擇熒光染料時(shí)，需根據儀器配置選擇能夠檢測的熒光染料。除此之外，如果您的細胞自帶熒光（如轉染了熒光蛋白的細胞或使用了帶熒光的藥物處理細胞），在儀器配置允許的前提下，優(yōu)先選擇與細胞自發(fā)熒光不同檢測通道的熒光染料。如果受限于儀器配置條件，無(wú)法避免熒光染料光譜重疊，要注意合理設置單染管用于調節補償，以確保檢測結果的準確性。
試劑盒種類(lèi) | 檢測樣本 | 檢測儀器 |
Annexin V凋亡檢測試劑盒 | 懸浮/貼壁細胞 | 流式細胞儀、熒光顯微鏡 |
TUNEL凋亡將測試劑盒 | 懸浮/貼壁細胞 | 流式細胞儀 |
細胞爬片/涂片、石蠟切片、冷凍切片 | 熒光顯微鏡 | |
Caspase活性檢測試劑盒 | 細胞、組織 | 分光光度計、酶標儀 |
線(xiàn)粒體膜電位（JC-1）檢測試劑盒 | 懸浮/貼壁細胞 | 熒光顯微鏡、流式細胞儀 |
以上是關(guān)于凋亡檢測試劑盒的知識科普及選擇指南，更多細胞培養和檢測相關(guān)干貨，請持續關(guān)注細胞學(xué)堂專(zhuān)欄~
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