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bEnd.3 [BEND3] (小鼠腦微血管內皮細胞)是從來(lái)自患有內皮瘤的小鼠腦組織中分離的內皮細胞，該細胞通過(guò)表達多瘤病毒中間T抗原的NTKmT逆轉錄病毒載體感染而轉化。在培養時(shí)，bEnd.3細胞最常遇到的問(wèn)題就是細胞形態(tài)變化和難消化，本期細胞學(xué)堂將幫您逐一解決。
細胞形態(tài)問(wèn)題
bEnd.3細胞本身生長(cháng)較慢，在低密度時(shí)會(huì )呈現不規則細胞形態(tài)，高密度時(shí)則呈規則纖維狀，所以若在培養過(guò)程中發(fā)現細胞形態(tài)異常，則有可能是細胞密度低，建議細胞鋪滿(mǎn)密度較高時(shí)傳代。以下為bEnd.3細胞不同密度培養圖片：
低密度（100倍鏡）
中密度（100倍鏡）
高密度（100倍鏡）
消化問(wèn)題
bEnd.3細胞培養時(shí)間越長(cháng)越難消化，培養4天傳代，一般消化3-5分鐘；培養7天傳代，一般消化5-10分鐘。具體消化時(shí)間以顯微鏡下觀(guān)察細胞狀態(tài)為準。
培養7天，消化5分鐘顯微圖
培養7天，消化10分鐘顯微圖
如遇到消化困難不必擔心，可通過(guò)分次消化的方式解決，具體操作方法如下（以T25瓶細胞為例）：
吸出原培養液；
加入2mL左右PBS，輕輕晃動(dòng)培養瓶潤洗細胞，吸出PBS丟棄；
加入1mL左右胰酶，輕輕晃動(dòng)培養瓶使之浸潤所有細胞；
放入培養箱消化，消化3-5分鐘（根據具體細胞稍作延長(cháng)或縮短），顯微鏡下看到細胞開(kāi)始漂浮，可以加入2mLPBS，晃動(dòng)培養瓶使細胞懸浮，不要吹打剩下的貼壁細胞；
吸出培養瓶?jì)鹊腜BS和細胞懸液，轉移到無(wú)菌離心管中，在離心管中加入3mL含血清的培養基終止消化并吹散細胞，使細胞盡量呈單顆細胞的懸浮液；
原培養瓶中加入0.5mL胰酶，晃動(dòng)培養瓶浸潤細胞，放入培養箱繼續消化，直到細胞塊中間全部收縮變圓，晃動(dòng)培養瓶可脫落；
用3mL含血清的培養基終止消化，將瓶底的細胞全部吹下，并輕輕吹吸分散細胞呈單顆；
收集細胞懸液與第一次消化下來(lái)的細胞合并到一個(gè)離心管；
離心收集細胞沉淀，1200rpm/min 3分鐘，離心完吸出上清丟棄；
加入新鮮培養基，吹打幾下混勻細胞，按需接種到新培養瓶，補足培養基，擰松瓶蓋或使用透氣瓶蓋進(jìn)行培養；
檢查培養箱二氧化碳，溫度和水盤(pán)。
培養小貼士
01
細胞培養過(guò)程中形態(tài)多樣，低密度時(shí)容易出現放射狀細胞，看似已經(jīng)鋪滿(mǎn)瓶底，其實(shí)細胞量較少，需要細胞胞體排列緊密的時(shí)候進(jìn)行傳代；
02
細胞培養過(guò)程中避免頻繁換液，可以每隔2-3天換液或者半量換液一次；
03
培養過(guò)程中會(huì )產(chǎn)生10%左右活的單顆漂浮細胞，貼壁細胞密度偏低時(shí)，注意收集懸浮細胞，貼壁細胞密度偏高時(shí)，可以換液時(shí)丟棄；
04
接種量對細胞生長(cháng)有影響，接種量過(guò)低細胞會(huì )有增殖緩慢，漂浮過(guò)多的現象，請注意控制傳代比例；
05
細胞對溫度和pH較敏感，傳代或換液前培養基可以常溫復溫4小時(shí)以上；避免使用pH改變（偏酸：顏色偏黃；偏堿：顏色偏紫紅）的培養基；
06
細胞傳代過(guò)程中若出現單次消化時(shí)間過(guò)長(cháng)，可進(jìn)行分次消化，切不可將細胞強行吹下來(lái)，以避免吹打造成細胞機械損傷。
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